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共聚焦顯微鏡常規(guī)樣品的制備要求

點(diǎn)擊次數(shù):1558 更新時(shí)間:2022-04-12

 

  共聚焦顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品,是當(dāng)今分子生物學(xué)和生命科學(xué)重要的分析儀器之一。共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像,在亞細(xì)胞水平上觀察諸多生理信號(hào)機(jī)細(xì)胞形態(tài)的變化,成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。
  共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測(cè)前的關(guān)鍵步驟。樣品需經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo))。
  標(biāo)本可以是固定的或活的組織,也可以是固定的或活的貼壁培養(yǎng),細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上,懸浮細(xì)胞,甩片或滴片后,用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm,使用的蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm,載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間,而且表面光潔,厚度均勻,沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進(jìn)行封片,常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
  常規(guī)樣品制備要求:
  1、染料的選擇
  由于共聚焦顯微鏡是以單一波長(zhǎng)的激光作為光源,因此在選擇熒光染料時(shí)要根據(jù)共聚焦顯微鏡配備的激光器波長(zhǎng)選擇,如果在同一樣品中有多種熒光染料標(biāo)記,還要考慮它們的發(fā)射波長(zhǎng)盡量不要重疊,避免串色問題。
  2、樣品承載物的選擇
  一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡,它的數(shù)值孔徑較小,要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm,因此如果觀察樣品為貼壁細(xì)胞或組織切片,可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細(xì)胞或懸浮粒子,可以用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿承載樣品進(jìn)行觀察。
  3、封片劑的選擇
  如果樣品只需要觀測(cè)一次并且不是極易淬滅的熒光,可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時(shí)間并多次拍攝,應(yīng)選用抗熒光淬滅的封片劑,以減少熒光信號(hào)丟失。


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